SALUD ANIMAL
Inicialmente, el diagnóstico de las enfermedades infecciosas que afectan a la industria avícola incluyó el aislamiento (ya sea en cultivo celular, huevos embrionados o en aves) y la identificación de lesiones macro y microscópicas. Posteriormente, las técnicas basadas en la detección de parte del agente infeccioso (antígenos) o de las defensas generadas tras su infección (anticuerpos) fueron incorporadas con gran éxito al diagnóstico laboratorial.
Desde entonces, las pruebas de ELISA vienen siendo utilizadas para detectar infección o para evaluar la respuesta humoral después de una inmunización. Estas técnicas tradicionales siguen siendo usadas y continuarán siendo utilizadas por mucho tiempo más, pero debe entenderse que son limitadas y muchas veces no pueden generar toda la información requerida.
Los microorganismos son seres en continuo proceso de adaptación y evolución, y al igual que las demás especies buscan subsistir y escapar de la presión inmunológica generada por las vacunas. Todo ello ha llevado a una ¨evolución¨ y búsqueda de nuevas técnicas laboratoriales que puedan ofrecer la información requerida.
Las técnicas moleculares usadas para el diagnóstico de patologías y enfermedades de seres humanos y animales fueron diseñadas gracias a los actuales conocimientos generados por la biología molecular en las últimas décadas. La biología molecular viene permitiendo un mejor entendimiento sobre la estructura y comportamiento de los microorganismos, la respuesta de los hospederos tras una infección y el resultado de la interacción agente-hospedero-medio ambiente.
Desde hace unas décadas, las técnicas moleculares, entre las que podemos citar: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) método convencional y en tiempo real, el análisis de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y la secuenciación de DNA, vienen siendo utilizadas en estudios epidemiológicos y en algunos países ya fueron incorporadas al diagnóstico de enfermedades.
Si bien es cierto que estas técnicas poseen un mayor poder discriminatorio, ellas requieren de personal capacitado para su estandarización, validación y sobretodo para la interpretación de los resultados. La aplicación de las técnicas genéticas en medicina son múltiples, ellas pueden utilizarse para la generación de nuevos conocimientos relacionados a etiología, patogenia, inmunidad y epidemiología.
Un ejemplo resaltante es la utilidad de estas técnicas en el estudio de enfermedades pandémicas, como el caso del virus de la gripe zoonótica. Sin duda, el rol de estas técnicas es fundamental para confeccionar modelos de distribución y diseminación viral.
En esta oportunidad revisaremos únicamente la utilidad de las técnicas genéticas para el estudio y diagnóstico de enfermedades que lleven a la implementación de medidas de control en la industria avícola.
El diagnóstico molecular se basa en la detección de secuencias de DNA de los microorganismos. Cada microorganismo contiene fragmentos específicos y diferenciables de otras especies, incluso entre serotipos y genotipos. Estos fragmentos de DNA se denominan "marcadores moleculares". Estos marcadores son bien conocidos para algunos agentes, pero en otros casos la información es escasa.
Por ejemplo, los virus que contienen su información genética en una secuencia de RNA suelen mostrar mayores diferencias entre las diferentes cepas, ya que ellas son más propensas a sufrir procesos de mutación y recombinación.
El aumento de la información genética de los diferentes agentes llevará sin duda a cambios en la nomenclatura y en la reorganización taxonómica de ellos. Podemos citar como ejemplos, la nueva clasificación de los Adenovirus de las aves, Avibacterium paragallinarum (antes denominado Haemophilus paragallinarum) y Metapneumovirus aviar (también conocido como TRT).
Podríamos mencionar algunos ejemplos en los cuales las técnicas moleculares vienen ayudando a resolver múltiples problemas en el campo.
Desde hace algunas décadas la PCR-RFLP viene siendo usada para conocer si un caso de laringotraqueítis infecciosa es originado por una cepa virulenta de campo o por una cepa vacunal atenuada. A través de la secuenciación de DNA podemos saber; sin la necesidad de pruebas In vivo, si una cepa de Influenza aviar es de alta o baja patogenicidad.
A través de la secuenciación y análisis filogenético del gen S del virus de la bronquitis infecciosa, podemos escoger la cepa vacunal que mejor protección brindará a nuestras aves en el campo.
Para esta enfermedad, recientemente ha sido reportado por varios autores, que la secuenciación de DNA es mejor indicador de protección que la neutralización viral.
Similar al caso de bronquitis infecciosa, la secuenciación de DNA también puede ayudarnos a conocer la cepa de campo de desafío del virus de la enfermedad de Gumboro, y tras ello podremos establecer el mejor programa vacunal.
La secuenciación de DNA puede decirnos si tenemos en nuestras granjas una cepa de desafío clásica, virulenta, muy virulenta o variante. De otro lado, se tiene que resaltar que la técnica de PCR asociada a la secuenciación de DNA, es la metodología predilecta para la detección de nuevos genotipos o incluso serotipos de algún patógeno.
En el caso de adenovirus, la PCR asociada a la secuenciación de DNA puede indicarnos el serotipo del virus, ya que son conocidos los marcadores moleculares asociados a serotipo.
El PCR sumado a la secuenciación de DNA permite conocer el subtipo de Metapneumovirus aviar que está circulando en nuestras granjas o región.
Debemos recordar que la protección cruzada entre subtipos A o B y el subtipo C es baja.
Por lo tanto, si usamos una vacuna del subtipo A o B, y tenemos un virus de desafío C, la protección ofrecida a las aves será muy limitada. La PCR y la secuenciación de DNA también pueden utilizarse para discriminar entre cepas vacunales y cepas de campo de Micoplasma gallisepticum.
Las técnicas moleculares pueden ser incorporadas a estudios de monitoreamiento y vigilancia epidemiológica de muchos agentes infecciosos. En el caso de Salmonella, podemos tener resultados en menos de 48 horas. Adicionalmente, estas técnicas pueden ser estandarizadas basadas en la detección de marcadores de patógenicidad, lo cual permitiría saber si las muestras de Salmonella detectadas son patogénicas o no.
La técnica de PCR en tiempo real es más reciente, y por ello menos accesible por su costo.
Además de su uso como técnica de diagnóstico, ella puede ser usada para medir la carga viral/ bacteriana después de una infección vacunal o de desafío. En un futuro no muy lejano ella debe ser usada para la titulación de vacunas, como ya viene siendo usada en el caso de la enfermedad de Marek.
Rutinariamente, la respuesta inmune es evaluada por la detección y titulación de anticuerpos generados por el agente inmunogénico (respuesta inmune humoral). Entonces la pregunta lógica sería: ¿Cómo medir la respuesta vacunal contra un agente que estimula básicamente la respuesta inmune celular? En algunos laboratorios de investigación, ya se viene utilizando la técnica de PCR en tiempo real para la cuantificación de las células y marcadores generados por una respuesta inmune de tipo celular (interleucinas, citoquinas, etc). Probablemente, esta metodología será incorporada en los próximos años al servicio de la veterinaria y de la avicultura comercial.
Quizás la trascendencia de las técnicas moleculares es más evidente en el caso de las enfermedades de los pavos. Utilizando las técnicas tradicionales, difícilmente podemos diagnosticar enfermedades causadas por agentes recientemente conocidos (enfermedades emergentes y/o exóticas).
Por ejemplo, el coronavirus, adenovirus y astrovirus de los pavos pueden ser solamente detectados con eficacia por las técnicas moleculares. Claro está que la patogenicidad de estos agentes no es bien clara.
Las técnicas de diagnóstico molecular usadas en muchos países han incorporado la metodología utilizada en investigaciones forenses. Al igual que en criminalística, ellas pueden ser usadas para llegar a detectar el causante de un brote, de esta manera podremos descubrir si algún problema en campo es generado por una cepa vacunal o una cepa de campo. Incluso, podemos detectar contaminaciones y conocer el origen de alguna cepa vacunal.
A través de estudios epidemiológicos, podemos conocer la procedencia geográfica de algún nuevo patógeno o su diseminación a otras regiones. Seguramente en los próximos años, los laboratorios biológicos pondrán a disposición la secuencia de DNA de cada producto, evitando con ello algún uso indebido. Es importante conocer las bondades de las técnicas moleculares, pero también debemos ser conscientes que es necesario un profesional entrenado y capacitado para utilizar estas metodologías y para la interpretación de los resultados.
Por ejemplo, se debe tener especial cuidado cuando se sospecha de coinfecciones. Muchas veces se pueden tener dos o más microorganismos colonizando las aves y solamente uno de ellos puede ser patogénico.
En este caso, la detección del agente no patogénico nos puede llevar a fracasos en las medidas terapéuticas y/o de control. En este tipo de situaciones, una técnica tradicional puede ayudarnos a clarificar la situación. La inversión y capacitación requerida para implementar estas técnicas llevó a que estos servicios estén disponibles en pocos países (principalmente EEUU y Europa). De otro lado, las lógicas restricciones para el transporte de material biológico hacia estos países por cuestiones de seguridad hicieron imposible el envío de muestras para estudios de caracterización.
Foto 4: Carga viral de aves desafiadas con el virus de Gumboro medida por la técnica de PCR en tinepo real.
Felizmente ya están disponibles comercialmente, unas tarjetas (llamadas FTA cards), las cuales permiten la remisión de material genético sin la necesidad del envío de material biológico. Dependiendo del país de destino, el envío por medio de estas tarjetas FTA es accesible y seguro.
Estas tarjetas contienen sustancias que inactivan VECTORMUNE FP - LT el virus o la bacteria, pero mantienen intáctil su material genético; y gracias a ello, es posible realizar análisis con ellas.
Las técnicas moleculares no sustituirán las técnicas tradicionales como el aislamiento, serología o la histopatología, pero si pueden ser más prácticas y eficientes, dependiendo del uso que se les pueda dar. Los profesionales de la industria avícola necesitan entender y utilizar la información proporcionada por estas técnicas, y los centros de investigación y laboratorios de diagnóstico están en la obligación de atender a esta demanda.
Finalmente, antes de pensar en cuánto puede costarnos el uso de una técnica molecular, deberíamos pensar en cuánto podríamos ahorrar, o quizás, cuánto podríamos dejar de perder después de hacer uso de ellas.
MV. MSc. PhD. Jorge Luis Chacón
Virología - Investigación y Desarrollo
Ceva Phylaxia (Hungría)
Actualidad Avipecuaria
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