Inicialmente, el diagnóstico de las enfermedades infecciosas que
afectan a la industria avícola incluyó el aislamiento (ya sea en cultivo
celular, huevos embrionados o en aves) y la identificación de lesiones
macro y microscópicas. Posteriormente, las técnicas basadas en la
detección de parte del agente infeccioso o de las defensas generadas
tras su infección fueron incorporadas con gran éxito al diagnóstico
laboratorial.
Inicialmente, el diagnóstico de las enfermedades infecciosas que
afectan a la industria avícola incluyó el aislamiento (ya sea en cultivo
celular, huevos embrionados o en aves) y la identificación de lesiones
macro y microscópicas. Posteriormente, las técnicas basadas en la
detección de parte del agente infeccioso (antígenos) o de las defensas
generadas tras su infección (anticuerpos) fueron incorporadas con gran
éxito al diagnóstico laboratorial.
Desde entonces, las pruebas de ELISA vienen siendo utilizadas para
detectar infección o para evaluar la respuesta humoral después de una
inmunización. Estas técnicas tradicionales siguen siendo usadas y
continuarán siendo utilizadas por mucho tiempo más, pero debe entenderse
que son limitadas y muchas veces no pueden generar toda la información
requerida.
Los microorganismos son seres en continuo proceso de adaptación y
evolución, y al igual que las demás especies buscan subsistir y escapar
de la presión inmunológica generada por las vacunas. Todo ello ha
llevado a una ¨evolución¨ y búsqueda de nuevas técnicas laboratoriales
que puedan ofrecer la información requerida.
Foto 1: Técnica de PCR-RFLP mostrando diferencias entre los patrones
moleculares de cepas de campo y vacunlae del virus de la
laringotraqueítis infecciosa.
Las técnicas moleculares usadas para el diagnóstico de patologías y
enfermedades de seres humanos y animales fueron diseñadas gracias a los
actuales conocimientos generados por la biología molecular en las
últimas décadas. La biología molecular viene permitiendo un mejor
entendimiento sobre la estructura y comportamiento de los
microorganismos, la respuesta de los hospederos tras una infección y el
resultado de la interacción agente-hospedero-medio ambiente.
Desde hace unas décadas, las técnicas moleculares, entre las que
podemos citar: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) método
convencional y en tiempo real, el análisis de la longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP) y la secuenciación de DNA, vienen
siendo utilizadas en estudios epidemiológicos y en algunos países ya
fueron incorporadas al diagnóstico de enfermedades.
Si bien es cierto que estas técnicas poseen un mayor poder
discriminatorio, ellas requieren de personal capacitado para su
estandarización, validación y sobretodo para la interpretación de los
resultados. La aplicación de las técnicas genéticas en medicina son
múltiples, ellas pueden utilizarse para la generación de nuevos
conocimientos relacionados a etiología, patogenia, inmunidad y
epidemiología.
Foto 2: Secuencia de nucleotidos del virus de la bronquitis infecciosa despues de la secuenciacion del gen S.
Un ejemplo resaltante es la utilidad de estas técnicas en el estudio
de enfermedades pandémicas, como el caso del virus de la gripe
zoonótica. Sin duda, el rol de estas técnicas es fundamental para
confeccionar modelos de distribución y diseminación viral.
En esta oportunidad revisaremos únicamente la utilidad de las técnicas
genéticas para el estudio y diagnóstico de enfermedades que lleven a la
implementación de medidas de control en la industria avícola.
El diagnóstico molecular se basa en la detección de secuencias de DNA
de los microorganismos. Cada microorganismo contiene fragmentos
específicos y diferenciables de otras especies, incluso entre serotipos y
genotipos. Estos fragmentos de DNA se denominan "marcadores
moleculares". Estos marcadores son bien conocidos para algunos agentes,
pero en otros casos la información es escasa.
Por ejemplo, los virus que contienen su información genética en una
secuencia de RNA suelen mostrar mayores diferencias entre las diferentes
cepas, ya que ellas son más propensas a sufrir procesos de mutación y
recombinación.
El aumento de la información genética de los diferentes agentes
llevará sin duda a cambios en la nomenclatura y en la reorganización
taxonómica de ellos. Podemos citar como ejemplos, la nueva clasificación
de los Adenovirus de las aves, Avibacterium paragallinarum (antes
denominado Haemophilus paragallinarum) y Metapneumovirus aviar (también
conocido como TRT).
Podríamos mencionar algunos ejemplos en los cuales las técnicas
moleculares vienen ayudando a resolver múltiples problemas en el campo.
Desde hace algunas décadas la PCR-RFLP viene siendo usada para
conocer si un caso de laringotraqueítis infecciosa es originado por una
cepa virulenta de campo o por una cepa vacunal atenuada. A través de la
secuenciación de DNA podemos saber; sin la necesidad de pruebas In vivo,
si una cepa de Influenza aviar es de alta o baja patogenicidad.
A través de la secuenciación y análisis filogenético del gen S del
virus de la bronquitis infecciosa, podemos escoger la cepa vacunal que
mejor protección brindará a nuestras aves en el campo.
Foto 3: Arbol filogenético mostrando cepas de diferentes subtipos de metapneumovirus (TRT)
Para esta enfermedad, recientemente ha sido reportado por varios
autores, que la secuenciación de DNA es mejor indicador de protección
que la neutralización viral.
Similar al caso de bronquitis infecciosa, la secuenciación de DNA
también puede ayudarnos a conocer la cepa de campo de desafío del virus
de la enfermedad de Gumboro, y tras ello podremos establecer el mejor
programa vacunal.
La secuenciación de DNA puede decirnos si tenemos en nuestras granjas
una cepa de desafío clásica, virulenta, muy virulenta o variante. De
otro lado, se tiene que resaltar que la técnica de PCR asociada a la
secuenciación de DNA, es la metodología predilecta para la detección de
nuevos genotipos o incluso serotipos de algún patógeno.
En el caso de adenovirus, la PCR asociada a la secuenciación de DNA
puede indicarnos el serotipo del virus, ya que son conocidos los
marcadores moleculares asociados a serotipo.
El PCR sumado a la secuenciación de DNA permite conocer el subtipo de
Metapneumovirus aviar que está circulando en nuestras granjas o región.
Debemos recordar que la protección cruzada entre subtipos A o B y el subtipo C es baja.
Por lo tanto, si usamos una vacuna del subtipo A o B, y tenemos un
virus de desafío C, la protección ofrecida a las aves será muy limitada.
La PCR y la secuenciación de DNA también pueden utilizarse para
discriminar entre cepas vacunales y cepas de campo de Micoplasma
gallisepticum.
Las técnicas moleculares pueden ser incorporadas a estudios de
monitoreamiento y vigilancia epidemiológica de muchos agentes
infecciosos. En el caso de Salmonella, podemos tener resultados en menos
de 48 horas. Adicionalmente, estas técnicas pueden ser estandarizadas
basadas en la detección de marcadores de patógenicidad, lo cual
permitiría saber si las muestras de Salmonella detectadas son
patogénicas o no.
La técnica de PCR en tiempo real es más reciente, y por ello menos accesible por su costo.
Además de su uso como técnica de diagnóstico, ella puede ser usada
para medir la carga viral/ bacteriana después de una infección vacunal o
de desafío. En un futuro no muy lejano ella debe ser usada para la
titulación de vacunas, como ya viene siendo usada en el caso de la
enfermedad de Marek.
Rutinariamente, la respuesta inmune es evaluada por la detección y
titulación de anticuerpos generados por el agente inmunogénico
(respuesta inmune humoral). Entonces la pregunta lógica sería: ¿Cómo
medir la respuesta vacunal contra un agente que estimula básicamente la
respuesta inmune celular? En algunos laboratorios de investigación, ya
se viene utilizando la técnica de PCR en tiempo real para la
cuantificación de las células y marcadores generados por una respuesta
inmune de tipo celular (interleucinas, citoquinas, etc). Probablemente,
esta metodología será incorporada en los próximos años al servicio de la
veterinaria y de la avicultura comercial.
Quizás la trascendencia de las técnicas moleculares es más evidente
en el caso de las enfermedades de los pavos. Utilizando las técnicas
tradicionales, difícilmente podemos diagnosticar enfermedades causadas
por agentes recientemente conocidos (enfermedades emergentes y/o
exóticas).
Por ejemplo, el coronavirus, adenovirus y astrovirus de los pavos
pueden ser solamente detectados con eficacia por las técnicas
moleculares. Claro está que la patogenicidad de estos agentes no es bien
clara.
Las técnicas de diagnóstico molecular usadas en muchos países han
incorporado la metodología utilizada en investigaciones forenses. Al
igual que en criminalística, ellas pueden ser usadas para llegar a
detectar el causante de un brote, de esta manera podremos descubrir si
algún problema en campo es generado por una cepa vacunal o una cepa de
campo. Incluso, podemos detectar contaminaciones y conocer el origen de
alguna cepa vacunal.
A través de estudios epidemiológicos, podemos conocer la procedencia
geográfica de algún nuevo patógeno o su diseminación a otras regiones.
Seguramente en los próximos años, los laboratorios biológicos pondrán a
disposición la secuencia de DNA de cada producto, evitando con ello
algún uso indebido. Es importante conocer las bondades de las técnicas
moleculares, pero también debemos ser conscientes que es necesario un
profesional entrenado y capacitado para utilizar estas metodologías y
para la interpretación de los resultados.
Por ejemplo, se debe tener especial cuidado cuando se sospecha de
coinfecciones. Muchas veces se pueden tener dos o más microorganismos
colonizando las aves y solamente uno de ellos puede ser patogénico.
En este caso, la detección del agente no patogénico nos puede llevar a
fracasos en las medidas terapéuticas y/o de control. En este tipo de
situaciones, una técnica tradicional puede ayudarnos a clarificar la
situación. La inversión y capacitación requerida para implementar estas
técnicas llevó a que estos servicios estén disponibles en pocos países
(principalmente EEUU y Europa). De otro lado, las lógicas restricciones
para el transporte de material biológico hacia estos países por
cuestiones de seguridad hicieron imposible el envío de muestras para
estudios de caracterización.
Foto 4: Carga viral de aves desafiadas con el virus de Gumboro medida por la técnica de PCR en tinepo real.
Felizmente ya están disponibles comercialmente, unas tarjetas
(llamadas FTA cards), las cuales permiten la remisión de material
genético sin la necesidad del envío de material biológico. Dependiendo
del país de destino, el envío por medio de estas tarjetas FTA es
accesible y seguro.
Estas tarjetas contienen sustancias que inactivan VECTORMUNE FP - LT
el virus o la bacteria, pero mantienen intáctil su material genético; y
gracias a ello, es posible realizar análisis con ellas.
Las técnicas moleculares no sustituirán las técnicas tradicionales
como el aislamiento, serología o la histopatología, pero si pueden ser
más prácticas y eficientes, dependiendo del uso que se les pueda dar.
Los profesionales de la industria avícola necesitan entender y utilizar
la información proporcionada por estas técnicas, y los centros de
investigación y laboratorios de diagnóstico están en la obligación de
atender a esta demanda.
Finalmente, antes de pensar en cuánto puede costarnos el uso de una
técnica molecular, deberíamos pensar en cuánto podríamos ahorrar, o
quizás, cuánto podríamos dejar de perder después de hacer uso de ellas.
MV. MSc. PhD. Jorge Luis Chacón
Virología - Investigación y Desarrollo
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